tibljТуберкулез и болезни легкихTuberculosis and Lung Diseases2075-12302542-1506Медицинские знания и технологии10.21292/2075-1230-2017-95-11-27-35tiblj-1060Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРА И ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ МУТАЦИЙ ГЕНА embB МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОГОКОМПЛЕКСА, АССОЦИИРУЕМЫХ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ЭТАМБУТОЛУ, МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙРЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИINVESTIGATION OF RANGES AND FREQUENCY OF MUTATIONS IN THE embB GENE IN MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS ASSOCIATED WITH RESISTANCE TO ETHAMBUTOL USING REAL-TIME POLYMERASE CHAINREACTIONАляпкинаЮ. С.АlyapkinаYu. S.

Аляпкина Юлия Сергеевна – ведущий научный сотрудник. 

127550, Москва, Тимирязевская, д. 42.

Yulia S. Alyapkina – Senior Researcher 

42, Timiryazevskaya St., Moscow, 127550

yulisyntol@mail.ruЛарионоваЕ. Е.LаrionovаE. E.

Ларионова Елена Евгеньевна –  старший научный сотрудник отдела микробиологии. 

107564, Москва, Яузская аллея, д. 2.

Elena E. Larionova – Senior Researcher of Microbiological Department. 

2, Yauzskaya Alleya, Moscow, 107564

СмирноваТ. Г.SmirnovаT. G.

Смирнова Татьяна Геннадьевна – старший научный сотрудник отдела микробиологии. 

107564, Москва, Яузская аллея, д. 2.

Tatyana G. Smirnova – Senior Researcher of Microbiological Department. 

2, Yauzskaya Alleya, Moscow, 107564

АлексеевЯ. И.АlekseevYa. I.

Алексеев Яков Игоревич – научный директор. 

127550, Москва, Тимирязевская, д. 42.

Yakov I. Alekseev – Scientific Director. 

42, Timiryazevskaya St., Moscow, 127550

ЧерноусоваЛ. Н.ChernousovаL. N.

Черноусова Лариса Николаевна – заведующая отделом микробиологии. 

107564, Москва, Яузская аллея, д. 2.

Larisa N. Chernousova – Head of Microbiology Department.

ВладимирскийМ. А.VlаdimirskiyM. A.

Владимирский Михаил Александрович – заведующий лабораторией иммунологических исследований и молекулярной диагностики туберкулеза 

127473, Москва, ул. Достоевского, д. 4.

Mikhail A. Vladimirsky – Head of Laboratory for Immunological Research and Molecular Diagnostics of Tuberculosis.

4, Dostoevsky St., Moscow, 127473

ООО «НПФ «Синтол»; НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И. М. СеченоваРоссияNPF Sintol; Research Institute of Phthisiopulmonology of I. M. Sechenov First Moscow State Medical UniversityRussian FederationФГБНУ «ЦНИИ туберкулеза»РоссияCentral Tuberculosis Research InstituteRussian FederationООО «НПФ «Синтол»; ФГБНУ «Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии»РоссияNPF Sintol; All-Russia Research Institute of Agricultural BiotechnologyRussian FederationНИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И. М. СеченоваРоссияResearch Institute of Phthisiopulmonology of I. M. Sechenov First Moscow State Medical UniversityRussian Federation20171112201795112735Copyright © Аляпкина Ю.С., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Г., Алексеев Я.И., Черноусова Л.Н., Владимирский М.А., 20172017Аляпкина Ю.С., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Г., Алексеев Я.И., Черноусова Л.Н., Владимирский М.А.Аlyapkinа Y.S., Lаrionovа E.E., Smirnovа T.G., Аlekseev Y.I., Chernousovа L.N., Vlаdimirskiy M.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.tibl-journal.com/jour/article/view/1060

На основе технологии аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени изучен спектр возможных мутаций в кодонах 306 и 406 гена embB Mycobacterium tuberculosis, ассоциированного с устойчивостью к этамбутолу. Выявлено 5 различных мутаций в кодоне 306 и 3 мутации – в кодоне 406 гена embB. Выявленные мутации подтверждены методами секвенирования и масс-спектрометрии. В результате анализа частоты встречаемости выявленных embB мутаций разработан набор реагентов для экспресс-определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) к этамбутолу методом мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР в реальном времени. Из 107 исследованных образцов клинических изолятов в 49 (45,8%) обнаружены мутации гена embB МБТ, в 58 (54,2%) – мутаций не обнаружено. В 39 (36,4%) образцах выявлены мутации в 306-м кодоне гена embB, в 9 (8,4%) – обнаружены мутации в 406-м кодоне, и 1 (0,9%) образец определен с мутациями и в 306-м, и в 406-м кодонах. Высокий уровень совпадения результатов молекулярно-генетического и бактериологического анализа лекарственной чувствительности/устойчивости (84%) показал высокую значимость мутаций в кодонах 306 и 406 гена embB МБТ и необходимость их обязательного определения для выявления этамбутол-устойчивых штаммов МБТ. При использовании молекулярно-генетического анализа установлен уровень чувствительности исследования 75,8% при специфичности относительно стандартных культуральных методов 95,6%.

Based on real-time allele-specific polymerase chain reaction, the ranges of potential mutations in codons of 306 and 405 of the embBgene in Mycobacterium tuberculosis associated with resistance to ethambutol were investigated. 5 different mutations were detected in codon 306 and 3 mutations were found in codon 406 of the embB gene. The detected mutations were confirmed by sequencing and mass spectrometry. By analyzing the frequency of detected mutations of , the set of reagents was developed for rapid testing of susceptibility tuberculous mycobacteria to ethambutol by multi-competitive allele-specific real-time PCR. Out of 107 tested specimens of clinical isolates, mutations of the embB gene of M. tuberculosis were detected in 49 (45.8%) specimens, and no mutations were found in 58 (52.2%) specimens. 39 (36.4%) specimens had mutations in codon 306 of the embB gene, and 9 (8.4%) specimens had a mutation in codon 406, and 1 (0.9%) specimen had mutations in both codons 306 and 406. The high level of agreement in the results of molecular genetic and bacteriological tests (84%) proved the significance of mutations in codons 306 and 406 of the embB gene in M. tuberculosis and the need for their identification in order to detect ethambutol resistant strains of M. tuberculosis. When using molecular genetic tests, the sensitivity level made 75.8%, while the specificity of standard culture-based methods makes 95.6%.

микобактерии туберкулезалекарственная устойчивостьэтамбутолаллель-специфичная ПЦР в реальном времениtuberculous mycobacteriadrug resistanceethambutolreal-time allele-specific PCRReferencesАляпкина Ю. С., Алексеев Я. И., Варламов Д. А., Домотенко Л. В., Шипина Л. К., Владимирский М. А. Разработка технологии ПЦР в реальном времени для экспресс-определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам резервного ряда: фторхинолонам, амикацину, капреомицину // Туб. и болезни легких. ‒ 2014. ‒ № 12. ‒ С. 69-75.Аlyapkina Yu.S., Аlekseev Ya.I., Varlamov D.А., Domotenko L.V., Shipina L.K., Vladimirskiy M.А. Development of real time PCRtechnology for rapid drug susceptibility testing of tuberculous mycobacteria to second line drugs: fluoruquinolones, amikacin, capreomicin. Tuberculosis and Lung Diseases, 2014, no. 12, pp. 69-75. (In Russ.)Владимирский М. А., Аляпкина Ю. С., Варламов Д. А., Алексеев Я. И. и др. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза // Пробл. туб. ‒ 2008. ‒ № 4. ‒ С. 38-44.Vladimirskiy M.А., Аlyapkina Yu.S., Varlamov D.А., Аlekseev Ya.I. et al. Application of PCR technique in real time for detection and monitoring of transmission of drug resistant strains of tuberculous mycobacteria. Probl. Tub., 2008, no. 4, pp. 38-44. (In Russ.)Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью / под ред. И. Бастиана. Изд. «Медицина и жизнь», 2003.I. Bastian. Tuberkulez s mnozhestvennoy lekarstvennoy ustojchivostyu. (Russ. Ed.: Multidrug-resistant Tuberculosis. Bastian, I., Portaels, F.). Meditsina i Zhizn Publ., 2003.Alyapkina Yu. S., Vladimirsky M. A., Varlamov D. A., Alekseev J. I., Shipina L. K. Rapid detection of M. tuberculosis gene mutations associated with drug resistance bymodified allele-specific real-time PCR. Abstracrs 16-th ERS Annual Congress, Septemder 2006 // Eur. Resp. J. ‒ 2006. ‒ Vol. 28, suppl. 50. ‒ P. 3456.Alyapkina Yu.S., Vladimirsky M.A., Varlamov D.A., Alekseev J.I., Shipina L.K. Rapid detection of M. tuberculosis gene mutations associated with drug resistance bymodified allele-specific real-time PCR. Abstracrs 16-th ERS Annual Congress, Septemder 2006. Eur. Resp. J., 2006, vol. 28, suppl. 50, pp. 3456.Dawei Shi et al. Characteristics of embB mutations in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Henan, China // J. Antimicrob. Chemother. ‒ 2011. ‒ Vol. 66. ‒ P. 2240-2247.Dawei Shi et al. Characteristics of embB mutations in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Henan, China. J. Antimicrob. Chemother., 2011, vol. 66, pp. 2240-2247..Hassan Safi et al. Allelic exchange and mutant selection demonstrate that common clinical embCAB gene mutations only modestly increase resistance to ethambutol in Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob. Agents Chemother. ‒ 2010. ‒ Vol. 54, № 1. ‒ P. 103-108.Hassan Safi et al. Allelic exchange and mutant selection demonstrate that common clinical embCAB gene mutations only modestly increase resistance to ethambutol in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother., 2010, vol. 54, no. 1, pp. 103-108.Plinke C. et al. EmbCAB sequence variation among ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates without emb306 mutation // J. Antimicrob. Chemother. ‒ 2010. ‒ Vol. 65. ‒ P. 1359-1367.Plinke C. et al. EmbCAB sequence variation among ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates without emb306 mutation. J. Antimicrob. Chemother., 2010, vol. 65, pp. 1359-1367.Sreevatsan S. et al. Ethambutol Resistance in Mycobacterium tuberculosis: Critical role of embB mutations // Antimicrob. Agents Chemother. ‒ 1997. ‒ Vol. 41, № 8. ‒ P. 1677-1681.Sreevatsan S. et al. Ethambutol Resistance in Mycobacterium tuberculosis: Critical role of embB mutations. Antimicrob. Agents Chemother., 1997, vol. 41, no. 8, pp. 1677-1681.Starks A. M. et al. Mutations at embB codon 306 are an important molecular indicator of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob. Agents Chemother. ‒ 2009. ‒ Vol. 53, № 3. ‒ P. 1061-1066.Starks A. M. et al. Mutations at embB codon 306 are an important molecular indicator of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother., 2009, vol. 53, no. 3, pp. 1061-1066.Zhang Y., Yew W. W. Механизмы развития лекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis // Туберкулез и легочные заболевания. ‒ 2011. ‒ Т. 2, № 1. ‒ С. 7-20.Zhang Y., Yew W.W. Molecular mechanisms of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis development. Tuberkulez i Legochnye Zabolevaniya, 2011, vol. 2, no. 1, pp. 7-20. (In Russ.)

The authors declare that there are no conflicts of interest present.