tibljТуберкулез и болезни легкихTuberculosis and Lung Diseases2075-12302542-1506Медицинские знания и технологии10.21292/2075-1230-2020-98-8-14-22tiblj-1448Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESТест-система для фенотипического определения лекарственной чувствительности клинических изолятов микобактерий туберкулеза на основе применения микобактериофаговMycobacteriophage-based test system for phenotypic drug sensitivity of clinical isolates of tuberculous mycobacteriaЛапенковаМ. Б.LapenkovaM. B.

Лапенкова Марина Борисовна, научный сотрудник лаборатории иммунопатологии и иммунодиагностики туберкулезной инфекции

127473, Москва, ул. Достоевского, д. 4

Marina B. Lapenkova, Researcher of Laboratory of Immunopathology and Immunodiagnostics of Tuberculosis Infection

4, Dostoevsky St., Moscow, 127473

manyshik@list.ruАрустамоваГ. А.АrustamovaG. A.

Арустамова Грета Артушевна, лаборант-исследователь лаборатории иммунопатологии и иммунодиагностики туберкулезной инфекции

127473, Москва, ул. Достоевского, д. 4

Greta A. Аrustamova, Research Assistant of Laboratory of Immunopathology and Immunodiagnostics of Tuberculosis Infection

4, Dostoevsky St., Moscow, 127473

alueva2011@mail.ruАляпкинаЮ. С.АlyapkinaYu. S.

Аляпкина Юлия Сергеевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунопатологии и иммунодиагностики туберкулезной инфекции

127473, Москва, ул. Достоевского, д. 4

Yulia S. Аlyapkina, Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher of Laboratory of Immunopathology and Immunodiagnostics of Tuberculosis Infection

4, Dostoevsky St., Moscow, 127473

yulisyntol@mail.ruФилипповП. H.FilippovP. N.

Филиппов Павел Николаевич, врач микробиологической лаборатории

127055, Москва, пл. Борьбы, д. 11

Pavel N. Filippov, Doctor of Microbiological Laboratory

11, Borby Sq., Moscow, 127055

eldig90@yandex.ruЛазебныйС. В.LazebnyS. V.

Лазебный Сергей Вячеславович, заведующий микробиологической лабораторией

127055, Москва, пл. Борьбы, д. 11

Sergey V. Lazebny, Head of Microbiological Laboratory

11, Borby Sq., Moscow, 127055

nelazebnyi@mail.ruВладимирскийМ. А.VladimirskiyM. A.

Владимирский Михаил Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией иммунопатологии и иммунодиагностики туберкулезной инфекции

127473, Москва, ул. Достоевского, д. 4

Mikhail A. Vladimirskiy, Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of Laboratory of Immunopathology and Immunodiagnostics of Tuberculosis Infection

4, Dostoevsky St., Moscow, 127473

mvladimirskij@mail.ruФГБУ «Национальный исследовательский медицинский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний» МЗ РФРоссияNational Medical Research Center of Phthisiopulmonology and Infectious DiseasesRussian FederationГБУЗ МО «Московский областной клинический противотуберкулезный диспансер»РоссияMoscow Regional Clinical TB DispensaryRussian Federation2020230920209881422Copyright © Лапенкова М.Б., Арустамова Г.А., Аляпкина Ю.С., Филиппов П.H., Лазебный С.В., Владимирский М.А., 20202020Лапенкова М.Б., Арустамова Г.А., Аляпкина Ю.С., Филиппов П.H., Лазебный С.В., Владимирский М.А.Lapenkova M.B., Аrustamova G.A., Аlyapkina Y.S., Filippov P.N., Lazebny S.V., Vladimirskiy M.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.tibl-journal.com/jour/article/view/1448

Проблема ускоренного фенотипического исследования лекарственной чувствительности клинических изолятов микобактерий туберкулеза (МБТ) остается актуальной.

Цель исследования

Цель исследования: разработка новой тест-системы для ускоренного фенотипического определения лекарственной чувствительности клинических изолятов МБТ к противотуберкулезным препаратам (ПТП) первого и второго рядов на основе применения литических микобактериофагов.

Материалы и методы

Материалы и методы. Культуры МБТ (108 клинических изолятов после первичного культивирования в системе Bactec MGIT) инкубировали 48 ч в присутствии ПТП, затем 48 ч после добавления литического микобактериофага D29. Последующая мультиплексная реакция полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяла провести количественный анализ ДНК МБТ и ДНК микобактериофага. Лекарственная чувствительность исследуемого образца оценивалась по величине различий пороговых уровней флюоресценции, соответствующих количеству микобактериофага, между контрольной и опытной пробой. Одновременно лекарственная чувствительность/устойчивость всех клинических изолятов МБТ после рекультивирования анализировалась в системе Bactec MGIT, который был принят в качестве эталонного метода.

Результаты исследования

Результаты исследования. Определение на основе применения литического микобактериофага лекарственной чувствительности/устойчивости 108 изолятов МБТ к четырем препаратам первого ряда и 90 изолятов к шести препаратам второго ряда ПТП продемонстрировало высокий уровень совпадения с результатами в системе Bactec MGIT. Это позволило определить 99,5%-ную чувствительность и 100%-ную специфичность метода для 3 препаратов первого ряда в целом; несколько ниже для этамбутола (86 и 96,9% соответственно), а также чувствительность 94,83% при специфичности 98,85% – для препаратов второго ряда.

The issue of rapid phenotypic drug sensitivity testing of clinical isolates of tuberculous mycobacteria remains relevant.

The objective of the study is to develop a new test system for rapid phenotypic drug sensitivity testing of MTB clinical isolates based on lytic mycobacteriophages, capable of testing resistance to first and second line drugs.

Subjects and methods

Subjects and methods. Cultures of MTB (108 clinical isolates after primary culturing in Bactec MGIT) were incubated for 48 hours with addition of anti-tuberculosis drugs, then for 48 hours more after adding lytic mycobateriophage D29. The subsequent multiplex reaction of the polymerase chain reaction in real time allowed performing quantitative analysis of MTB DNA and mycobacteriophage DNA. The drug sensitivity of the tested sample was assessed by ranges of the differences in fluorescence threshold levels corresponding to the amount of mycobacteriophages between the control and test sample. At the same time, the drug sensitivity/resistance of all MTB clinical isolates after repeated culture was tested by Bactec MGIT which was adopted as a reference method.

Results

Results. Lytic mycobacteriophage-based drug sensitivity testing of 108 MTB isolated to four first line drugs and 90 isolates to six second line anti-tuberculosis drugs demonstrated a high level of concordance with the results of the Bactec MGIT system. It provided 99.5% sensitivity and 100% specificity of the method for 3 first-line drugs; it was slightly lower for ethambutol (86 and 96.9%, respectively), while for second line drugs, its sensitivity made 94.83% and specificity - 98.85%.

микобактерии туберкулезалекарственная чувствительностьмикобактериофагполимеразная цепная реакцияtuberculous mycobacteriadrug sensitivitymycobacteriophagepolymerase chain reactionReferencesАляпкина Ю. С., Алексеев Я. И., Варламов Д. А., Домотенко Л. В., Шипи- на Л. К., Владимирский М. А. Разработка технологии ПЦР в реальном времени для экспресс-определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам резервного ряда: фторхинолонам, амикацину и капреомицину // Туб. и болезни легких. – 2014. – № 12. – С. 69-75.Аlyapkina Yu.S., Аlekseev Ya.I., Varlamov D.А., Domotenko L.V., Shipina L.K., Vladimirskiy M.А. Development of real-time PCR technology for rapid drug susceptibility testing of tuberculous mycobacteria to second line drugs: fluoroquinolones, amikacin, capreomycin. Tuberculosis and Lung Diseases, 2014, no. 12, pp. 69-75. (In Russ.)Аляпкина Ю. С., Ларионова Е. Е., Смирнова Т. Г., Алексеев Я. И., Черноусова Л. Н., Владимирский М. А. Изучение спектра и частоты встречаемости мутаций гена embB микобактерий туберкулезного комплекса, ассоциируемых с устойчивостью к этамбутолу, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени // Туб. и болезни легких – 2017. – Т. 95, № 11. – С. 27-35. DOI: 10.21292/2075-1230-2017-95-11-27-35.Аlyapkina Yu.S., Larionova E.E., Smirnova T.G., Аlekseev Ya.I., Chernousova L.N., Vladimirskiy M.А. Investigation of ranges and frequency of mutations in the embB gene in Mycobacterium tuberculosis associated with resistance to ethambutol using real-time polymerase chain reaction. Tuberculosis and Lung Diseases, 2017, vol. 95, no. 11, pp. 27-35. (In Russ.) doi: 10.21292/2075-1230-2017-95-11-27-35.Владимирский М. А., Аляпкина Ю. С., Варламов Д. А. и др. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза // Пробл. туберкулеза и болезней легких. – 2008. – № 4. – С. 38-44.Vladimirskiy M.А., Аlyapkina Yu.S., Varlamov D.А. et al. Use of real-time PCR for detection and monitoring of transmission of drug resistant strains of tuberculous mycobacteria. Probl. Tuberkuleza i Bolezni Legkikh, 2008, no. 4, pp. 38-44. (In Russ.)Домотенко Л. В., Морозова Т. П., Шемякин И. Г., Шелепин А. П. Опыт использования ТБ тест набора для ускоренного определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis // Клиническая лабораторная диагностика. – 2020. – Т. 65, № 2. – С. 122-130.Domotenko L.V., Morozova T.P., Shemyakin I.G., Shelepin А.P. Experience of the use of TB test kit for rapid drug susceptibility testing of M. tuberculosis. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika, 2020, vol. 65, no. 2, pp. 122-130. (In Russ.)Михайлович В. М., Лапа С. А., Грядунов Д. А., Владимирский М. А., Шипи- на Л. К. и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ-микробиочипе для обнаружения рифампицин-резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2001. – Т. 131, № 1. – С. 112-117.Mikhaylovich V.M., Lapa S.А., Gryadunov D.А., Vladimirskiy M.А., Shipina L.K. et al. Use of hybridization and PCR techniques on the special TB microchip for detection of Rifampicin resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. Byulleten Eksperimentalnoy Biologii i Meditsiny, 2001, vol. 131, no. 1, pp. 112-117. (In Russ.)Смирнова Н. С., Шипина Л. К., Лапенкова М. Б., Владимирский М. А. Применение литического микобактериофага D29 для разработки ускоренного фенотипического метода определения чувствительности микобактерий туберкулеза к широкому спектру противотуберкулезных препаратов // Клиническая лабораторная диагностика. – 2017. – Т. 62, № 12 – С. 757-763.Smirnova N.S., Shipina L.K., Lapenkova M.B., Vladimirskiy M.А. The use of lytic mycobacteriophage D29 to develop the rapid phenotypic method to test sensitivity of tuberculous mycobacteria to a wide range of anti-tuberculosis drugs. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika, 2017, vol. 62, no. 12, pp. 757-763. (In Russ.)Clopper-Pearson Confidience Interval; Clopper C., Pearson E. (1934). The use of confidence or fiducial limits illustrated in the case of the binomial // Biometrika. ‒ Vol. 26, № 4. ‒ Р. 404-413. doi:10.2307/2331986.Clopper-Pearson Confidience Interval; Clopper C., Pearson E. (1934). The use of confidence or fiducial limits illustrated in the case of the binomial. Biometrika, vol. 26, no. 4, pp. 404-413. doi:10.2307/2331986.Denkinger C. M., Schumacher S. G., Boehme C. C. et al. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis: a systematic review and meta-analysis // Eur. Respir. J. – 2014. ‒ Vol. 44. – P. 435-446.Denkinger C.M., Schumacher S.G., Boehme C.C. et al. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Eur. Respir. J., 2014, vol. 44, pp. 435-446.Dicks Kr., Stout J. Molecular diagnostics for Mycobacterium tuberculosis infection // Ann. Rev. Med. – 2019. – Vol. 70. – P. 77-90.Dicks Kr., Stout J. Molecular diagnostics for Mycobacterium tuberculosis infection. Ann. Rev. Med., 2019, vol. 70, pp. 77-90.Foonglada S., Klayut W., Chinli R., Pholwat S. et al. Use of mycobacteriophage quantitative PCR on MGIT broths for a rapid tuberculosis antibiogram // J. Clin. Microbiol. – 2014. – Vol. 52, № 5. – P. 1523-1528.Foonglada S., Klayut W., Chinli R., Pholwat S. et al. Use of mycobacteriophage quantitative PCR on MGIT broths for a rapid tuberculosis antibiogram. J. Clin. Microbiol., 2014, vol. 52, no. 5, pp. 1523-1528.Genestet C., Hodille E., Berland J. L. et al. Whole-genome sequencing in drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in routine practice in Lyon, France // Int. J. Antimicrob. Agents. – 2020. – doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.105912.Genestet C., Hodille E., Berland J.L. et al. Whole-genome sequencing in drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in routine practice in Lyon, France. Int. J. Antimicrob. Agents, 2020, doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.105912.Global tuberculosis report 2019. World Health Organisation – 2019.Global tuberculosis report 2019. World Health Organisation, 2019.Grace Lin S., Desmond E., Bonato D., Gross W., Siddiqi S. Multicenter Evaluation of BACTEC MGIT 960 System for Second Line Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Complex // J. Clin. Microbiol. – 2009. – Vol. 47, № 11. – P. 3630-3634.Grace Lin S., Desmond E., Bonato D., Gross W., Siddiqi S. Multicenter Evaluation of BACTEC MGIT 960 System for Second Line Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Clin. Microbiol., 2009, vol. 47, no. 11, pp. 3630-3634.Heyckendorf J., Andres S., Koser Cl. et al. What is a resistance. Impact of phenotypic versus Molecular drug resistance testing on therapy for multi and extensively drug resistant tuberculosis // Antimicrob. Agents Chemother. – 2018. – Vol. 62. – P. 1-12.Heyckendorf J., Andres S., Koser Cl. et al. What is a resistance. Impact of phenotypic versus Molecular drug resistance testing on therapy for multi and extensively drug resistant tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother., 2018, vol. 62, pp. 1-12.Horne D. J., Pinto L. M., Arentz M., Lin S.-Y. G., Desmond E., Flores L. L. et al. Diagnostic accuracy and reproducibility of WHO-endorsed phenotypic drug susceptibility testing methods for first-line and second-line antituberculosis drugs // J. Clin. Microbiol – 2013. – Vol. 51. – P. 393-401.Horne D.J., Pinto L.M., Arentz M., Lin S.-Y.G., Desmond E., Flores L.L. et al. Diagnostic accuracy and reproducibility of WHO-endorsed phenotypic drug susceptibility testing methods for first-line and second-line antituberculosis drugs. J. Clin. Microbiol., 2013, vol. 51, pp. 393-401.Hunt M., Bradley Ph., Lapierre S. et al. Antibiotic resistance prediction for Mycobacterium tuberculosis from genome sequence data with Mykrobe // Wellcome Open Research. – 2019. – Vol. 4. – P. 1-32.Hunt M., Bradley Ph., Lapierre S. et al. Antibiotic resistance prediction for Mycobacterium tuberculosis from genome sequence data with Mykrobe. Wellcome Open Research, 2019, vol. 4, pp. 1-32.Nathavitharama R., Cudahy P., Shumacher S et al. Accuracy of line probe assays for the diagnosis of pulmonary and multidrug-resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis // Eur. Respir. J. – 2017. – Vol. 49. doi: 10.1183/13993003.01075-2016.Nathavitharama R., Cudahy P., Shumacher S et al. Accuracy of line probe assays for the diagnosis of pulmonary and multidrug-resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Eur. Respir. J., 2017, vol. 49. doi: 10.1183/13993003.01075-2016.Nosova E., Zimenkov D., Khakhalina A. A сomparison of the Sensititre MycoTB Plate, Bactec MGIT 960, and a microarray-based molecular assay for the detection of drug resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Moscow, Russia // PLOS One – 2016. doi: 10.1371/journal.pone.0167093.Nosova E., Zimenkov D., Khakhalina A. A сomparison of the Sensititre MycoTB Plate, Bactec MGIT 960, and a microarray-based molecular assay for the detection of drug resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Moscow, Russia. PLOS One, 2016. doi: 10.1371/journal.pone.0167093.Pholwat S., Ehdaie B., Foongladda S., Kelly K., Houpt E. Real-time PCR using mycobacteriophage DNA for rapid phenotypic drug susceptibility results for Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiology – 2012. – Vol. 50, № 3. – P. 754-761.Pholwat S., Ehdaie B., Foongladda S., Kelly K., Houpt E. Real-time PCR using mycobacteriophage DNA for rapid phenotypic drug susceptibility results for Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiology, 2012, vol. 50, no. 3, pp. 754-761.Rice J. P., Seifert M., Moser K. S., Rodwell T. C. Performance of the Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis and rifampin resistance in a low-incidence, high-resource setting // PLOS One. – 2017. – Vol. 12. doi: 10.1371/journal.pone.0186139.Rice J.P., Seifert M., Moser K.S., Rodwell T.C. Performance of the Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis and rifampin resistance in a low-incidence, high-resource setting. PLoS One, 2017, vol. 12. doi: 10.1371/journal.pone.0186139.Schön T., Miotto P., Köser C. U., Viveiros M., Böttger E., Cambau E. Mycobacterium tuberculosis drug-resistance testing: challenges, recent developments and perspectives. // Clin. Microbiol. Infect – 2017. – Vol. 23. – P. 154-160.Schön T., Miotto P., Köser C.U., Viveiros M., Böttger E., Cambau E. Mycobacterium tuberculosis drug-resistance testing: challenges, recent developments and perspectives. Clin. Microbiol. Infect., 2017, vol. 23, pp. 154-160.van Beek J., Haanpera M., Smit P. et al. Evaluation of whole genome sequencing and software tools for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // Clin. Microbiol. Infection. – 2019. – Vol. 25. – P. 82-86.van Beek J., Haanpera M., Smit P. et al. Evaluation of whole genome sequencing and software tools for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infection, 2019, vol. 25, pp. 82-86.Walker T. M., Kohl T. A., Omar S. V. et al. Whole-genome sequencing for prediction of Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility and resistance: a retrospective cohort study // Lancet Infect. Dis. – 2015. – Vol. 15. – P. 1193-1202.Walker T.M., Kohl T.A., Omar S.V. et al. Whole-genome sequencing for prediction of Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility and resistance: a retrospective cohort study. Lancet Infect. Dis., 2015, vol. 15, pp. 1193-1202.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.