tibljТуберкулез и болезни легкихTuberculosis and Lung Diseases2075-12302542-1506Медицинские знания и технологии10.58838/2075-1230-2023-101-1S-57-63tiblj-1757Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESВзаимодействие мезенхимальных стромальных клеток и микобактерий туберкулеза in vitroInteraction between mesenchymal stromal cells and tuberculous mycobacteria in vitrohttps://orcid.org/0000-0002-3481-3793БелогородцевС. Н.BelogorodtsevS. N.Белогородцев Сергей Николаевич, К.м.н., ведущий научный сотрудник  лабораторно-экспериментального отдела

630040, Новосибирск, ул. Охотская, д. 81А 

Sergey N. Belogorodtsev, Candidate of Medical Sciences, Leading Researcher of Laboratory Experimental Department

81a, Okhotskaya St., Novosibirsk, 630040 

s.belogorodtsev@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4897-8676ЛыковА. П.LykovA. P.

Лыков Александр Петрович,  К.м.н., старший научный сотрудник  лабораторно-экспериментального отдела 

630040, Новосибирск, ул. Охотская, д. 81А 

Aleksandr P. Lykov, Candidate of Medical Sciences, Senior Researcher of Laboratory Experimental Department 

81a, Okhotskaya St., Novosibirsk, 630040 

aplykov2@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2724-9546НемковаЕ. К.NemkovaE. K.

Немкова Елизавета Кирилловна  Младший научный сотрудник  лабораторно-экспериментального отдела 

630040, Новосибирск, ул. Охотская, д. 81А 

Elizaveta K. Nemkova, Junior Researcher of Children  and Adolescents Department 

81a, Okhotskaya St., Novosibirsk, 630040 

elizaveta.nemkova@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3036-9795ШварцЯ. Ш.SchwartzYa. Sh.Шварц Яков Шмульевич, Д.м.н., заместитель директора по научной работе  

630040, Новосибирск, ул. Охотская, д. 81А 

Yakov Sh. Schwartz, Doctor of Medical Sciences, Deputy Director for Research

81a, Okhotskaya St., Novosibirsk, 630040 

yshschwartz@mail.ruФБГУ «Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза» МЗ РФРоссияNovosibirsk Tuberculosis Research Institute, Russian Ministry of HealthRussian Federation2023271020231011S5763Copyright © Белогородцев С.Н., Лыков А.П., Немкова Е.К., Шварц Я.Ш., 20232023Белогородцев С.Н., Лыков А.П., Немкова Е.К., Шварц Я.Ш.Belogorodtsev S.N., Lykov A.P., Nemkova E.K., Schwartz Y.S.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.tibl-journal.com/jour/article/view/1757Цель исследования

Цель исследования: в эксперименте in vitro сравнивали фагоцитарные показатели мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и макрофагов в отношении микобактерий туберкулеза, оценивали способность МСК и макрофагов лизировать микобактерии или поддерживать их внутриклеточный рост, их влияние на формирование фенотипической лекарственной устойчивости микобактерий, а также влияние микобактерий туберкулеза на тип клеточной гибели МСК..

Материалы и методы

Материалы и методы. В работе были использованы линейные мыши Balb/c, самцы возрастом от 6 до 8 недель. МСК костного мозга получали из бедренных и большеберцовых костей путем дальнейшего культивирования, перитонеальные макрофаги элиситировали 4% альфа-глюканом. Внутриклеточное содержание микобактерий подсчитывали с помощью конфокального микроскопа при увеличении х 400. Определение чувствительности микобактерий к изониазиду и формирование фенотипической лекарственной устойчивости после культивирования МСК и макрофагов с патогеном на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсен оценивали путем подсчета КОЕ. Количество апоптотических и некротизированных МСК и макрофагов определяли через 5 суток после инфицирования, используя проточный цитофлуориметр.

Результаты

Результаты. На 1-е сутки общее количество фагоцитированных МБТ, как и количество фагоцитарно-активных макрофагов, превышает соответствующие показатели для МСК более чем в 2 раза. МСК фагоцитируют микобактерии туберкулеза в меньшем количестве, но размножение патогена в них происходит активнее: количество КОЕ после 7-ми суток культивирования клеток с патогеном превышало соответствующий показатель после 24 часов культивирования почти в 50 раз. В культурах инфицированных МСК, культивируемых в течение 7 суток, независимо от присутствия изониазида отмечается бурный рост микобактерий туберкулеза. В культуре макрофагов на 5-е сутки после инфицирования микобактериями туберкулеза количество клеток в состоянии некроза было в 2,7 раза больше, чем неинфицированных некротизированных макрофагов, но количество апототических клеток в этих группах различалось незначительно. В культуре МСК инфицированных клеток в состоянии некроза было в 8,5 раз больше, чем неинфицированных некротизированных МСК, и число некротизированных МСК в 4,5 раза превосходило число МСК с апоптозом, тогда как в культуре инфицированных макрофагов число некротизированных клеток было таким же, как число апоптотических клеток. Обработка изониазидом МСК, в отличие от макрофагов, не сдерживала внутриклеточную пролиферацию МБТ.

Заключение

Заключение. МСК обладают способностью фагоцитировать микобактерии, но делают это менее активно, чем макрофаги и, в отличие от макрофагов, не способны сдерживать размножение микобактерий туберкулеза. Микобактерии обладают фенотипической лекарственной устойчивостью в МСК. В МСК при инфицировании микобактериями туберкулеза отмечается выраженный сдвиг типа клеточной гибели в сторону некроза, что может приводить к диссеминации патогена и развитию локальных деструктивных изменений.

The objective

The objective: in an in vitro experiment, we compared phagocytic parameters of mesenchymal stromal cells (MSCs) and macrophages to tuberculous mycobacteria, assessed the ability of MSCs and macrophages to lyse mycobacteria or maintain their intracellular growth, their effect on formation of phenotypic drug resistance of mycobacteria, as well as the effect of tuberculous mycobacteria on the type of MSCs cell death.

Subjects and Methods

Subjects and Methods. Balb/c male mice, aged 6 to 8 weeks, were used in the experiment. Bone marrow MSCs were obtained from femurs and tibias by further cultivation, peritoneal macrophages were elicited with 4% alpha-glucan. The intracellular content of mycobacteria was counted using a confocal microscope with x 400 magnification. Susceptibility of mycobacteria to isoniazid and development of phenotypic drug resistance after culturing MSCs and macrophages with MTB on Lowenstein–Jensen medium was assessed by counting CFU. In 5 days after the infection, the number of apoptotic and necrotic MSCs and macrophages was determined by a flow cytometer.

Results

Results. On Day 1, the total number of phagocytosed MTB, as well as the number of phagocytic-active macrophages, exceeds the corresponding figures for MSCs more than twice. MSCs phagocytize tuberculous mycobacteria in a smaller amount, but MTB reproduces in them more actively: the number of CFU after 7 days of cell cultivation with MTB exceeded the corresponding parameter by almost 50 times after 24 hours of cultivation. In cultures of infected MSCs cultivated for 7 days, regardless of the presence of isoniazid, there was a rapid growth of tuberculous mycobacteria. On Day 5 after infection of macrophage culture with tuberculous mycobacteria, the number of necrotic cells was 2.7 times greater than that of uninfected necrotic macrophages, but the number of apototic cells in these groups differed slightly. In the culture of MSCs, there were 8.5 times more infected nectrotic cells versus uninfected necrotic MSCs, and the number of necrotic MSCs was 4.5 times higher than the number of MSCs with apoptosis, while in the culture of infected macrophages, the number of necrotic cells was the same as number of apoptotic cells. Unlike macrophages, treatment of MSCs with isoniazid did not inhibit the intracellular proliferation of MTB.

Conclusion

Conclusion. MSCs have the ability to phagocytose mycobacteria, but they do it less actively than macrophages and, unlike macrophages, they are not able to restrain the reproduction of tuberculous mycobacteria. Mycobacteria have phenotypic drug resistance in MSCs. In MSCs, when infected with tuberculous mycobacteria, there is a pronounced shift towards necrosis in the type of cell death, which can lead to dissemination of MTB and development of local destructive changes.

стромальные клеткинекрозапоптозфагоцитозтуберкулезstromal cellsnecrosisapoptosisphagocytosistuberculosisReferencesAdigun R., Basit H., Murray J. Necrosis. Cell (Liquefactive, Coagulative, Caseous, Fat, Fibrinoid, and Gangrenous). // StatPearls – Treasure Island (FL): StatPearls Publishing. – 2020. – P. 12.Adigun R., Basit H., Murray J. Necrosis. Cell (Liquefactive, Coagulative, Caseous, Fat, Fibrinoid, and Gangrenous). // StatPearls – Treasure Island (FL): StatPearls Publishing. – 2020. – P. 12.Das B., Kashino S. S., Pulu I., Kalita D., Swami V., Yeger H., Felsher D. W., Campos-Neto A. CD271+ Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells May Provide a Niche for Dormant Mycobacterium tuberculosis // Science Translational Medicine. – 2013. – Vol. 5. – № 170. – P. 170.Das B., Kashino S. S., Pulu I., Kalita D., Swami V., Yeger H., Felsher D. W., Campos-Neto A. CD271+ Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells May Provide a Niche for Dormant Mycobacterium tuberculosis // Science Translational Medicine. – 2013. – Vol. 5. – № 170. – P. 170.Fatima S., Kamble S., Dwivedi V., Bhattacharya D., Kumar S., Ranganathan A., Kaer L., Mohanty S., Das G. Mycobacterium Tuberculosis ProgramsFatima S., Kamble S., Dwivedi V., Bhattacharya D., Kumar S., Ranganathan A., Kaer L., Mohanty S., Das G. Mycobacterium Tuberculosis ProgramsMesenchymal Stem Cells to Establish Dormancy and Persistence. // The Journal of Clinical Investigation. – 2020. – Vol. 130, № 2. – P. 655–661.Mesenchymal Stem Cells to Establish Dormancy and Persistence. // The Journal of Clinical Investigation. – 2020. – Vol. 130, № 2. – P. 655–661.Garhyan, J., Bhuyan S., Pulu I., Kalita D., Das B., Bhatnagar R. Preclinical and Clinical Evidence of Mycobacterium tuberculosis Persistence in the HypoxicGarhyan, J., Bhuyan S., Pulu I., Kalita D., Das B., Bhatnagar R. Preclinical and Clinical Evidence of Mycobacterium tuberculosis Persistence in the HypoxicNiche of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells after Therapy. // The American Journal of Pathology. – 2015. – Vol. 185, № 7. – P. 1924–1934.Niche of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells after Therapy. // The American Journal of Pathology. – 2015. – Vol. 185, № 7. – P. 1924–1934.Jain N., Kalam H., Singh L., Sharma V., Kedia S., Das P., Ahuja V., Kumar D. Mesenchymal stem cells offer a drug-tolerant and immune-privileged niche to Mycobacterium tuberculosis. // Nature Communications. – 2020. – Vol. 11, № 1. – P. 3062.Jain N., Kalam H., Singh L., Sharma V., Kedia S., Das P., Ahuja V., Kumar D. Mesenchymal stem cells offer a drug-tolerant and immune-privileged niche to Mycobacterium tuberculosis. // Nature Communications. – 2020. – Vol. 11, № 1. – P. 3062.Karaji N., Sattentau Q.J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. // Front. Immunol. – 2017. – Vol. 8. – P. 1863.Karaji N., Sattentau Q.J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. // Front. Immunol. – 2017. – Vol. 8. – P. 1863.Khan A., Mann L., Papanna R., Lyu M. A., Singh C. R., Olson S, Eissa N. T.,Khan A., Mann L., Papanna R., Lyu M. A., Singh C. R., Olson S, Eissa N. T.,Cirillo J., Das G., Hunter R. L., Jagannath C. Mesenchymal stem cells internalizeCirillo J., Das G., Hunter R. L., Jagannath C. Mesenchymal stem cells internalizeMycobacterium tuberculosis through scavenger receptors and restrict bacterial growth through autophagy. // Scientific Reports. – 2017. – Vol. 7, № 1. – P. 15010.Mycobacterium tuberculosis through scavenger receptors and restrict bacterial growth through autophagy. // Scientific Reports. – 2017. – Vol. 7, № 1. – P. 15010.Laskin D. L., Sunil V. R., Gardner C. R., Laskin J. D. Macrophages and tissue injury: agents of defense or destruction? // Annu Rev Pharmacol Toxicol. – 2011. – Vol. 51. – P. 267–288.Laskin D. L., Sunil V. R., Gardner C. R., Laskin J. D. Macrophages and tissue injury: agents of defense or destruction? // Annu Rev Pharmacol Toxicol. – 2011. – Vol. 51. – P. 267–288.Neharika J., Haroon K., Lakshyaveer S., Sharma V., Kedia S., Das P., Ahuja V., Kumar D. Mesenchymal stem cells offer a drug-tolerant and immune-privileged niche to Mycobacterium tuberculosis. // Nature Communications. – 2020. – Vol. 11, № 1. – P. 3062.Neharika J., Haroon K., Lakshyaveer S., Sharma V., Kedia S., Das P., Ahuja V., Kumar D. Mesenchymal stem cells offer a drug-tolerant and immune-privileged niche to Mycobacterium tuberculosis. // Nature Communications. – 2020. – Vol. 11, № 1. – P. 3062.Raghuvanshi S., Sharma P., Singh S., Kaer L. V. Das G. Mycobacterium tuberculosis evades host immunity by recruiting mesenchymal stem cells. // Proceedings of the National Academy of Science of the USA. – 2010. – Vol. 107, № 50. – Р. 21653–21658.Raghuvanshi S., Sharma P., Singh S., Kaer L. V. Das G. Mycobacterium tuberculosis evades host immunity by recruiting mesenchymal stem cells. // Proceedings of the National Academy of Science of the USA. – 2010. – Vol. 107, № 50. – Р. 21653–21658.Shirato K., Kasuga K., Sato S., Ishii H. Physiological Role of Alveolar Macrophage in Acute Lower Respiratory Tract Infection: Phagocytosis and Aging // Phagocytosis – Main Key of Immune System [Working Title]. – IntechOpen. – 2023. – P. 23.Shirato K., Kasuga K., Sato S., Ishii H. Physiological Role of Alveolar Macrophage in Acute Lower Respiratory Tract Infection: Phagocytosis and Aging // Phagocytosis – Main Key of Immune System [Working Title]. – IntechOpen. – 2023. – P. 23.Skrahin A., Ahmed R. K., Ferrara G., Rane L., Poiret T., Isaikina Y., Skrahina A., Zumla A., Maeurer M. J. Autologous mesenchymal stromal cell infusion as adjunct treatment in patients with multidrug and extensively drug-resistant tuberculosis: an open-label phase 1 safety trial // Lancet Respir Med. – 2014. – Vol. 2, № 2. – P. 108–122.Skrahin A., Ahmed R. K., Ferrara G., Rane L., Poiret T., Isaikina Y., Skrahina A., Zumla A., Maeurer M. J. Autologous mesenchymal stromal cell infusion as adjunct treatment in patients with multidrug and extensively drug-resistant tuberculosis: an open-label phase 1 safety trial // Lancet Respir Med. – 2014. – Vol. 2, № 2. – P. 108–122.Stamm C. E., Collins A. C., Shiloh M. U. Sensing of Mycobacterium tuberculosis and consequences to both host and bacillus. // Immunological Reviews. – 2015. – Vol. 264, № 1. – P. 204–219.Stamm C. E., Collins A. C., Shiloh M. U. Sensing of Mycobacterium tuberculosis and consequences to both host and bacillus. // Immunological Reviews. – 2015. – Vol. 264, № 1. – P. 204–219.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.