tibljТуберкулез и болезни легкихTuberculosis and Lung Diseases2075-12302542-1506Медицинские знания и технологии10.21292/2075-1230-2016-94-9-80-87tiblj-934Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESВыявление и дифференциация нетуберкулезных микобактерий и микобактерий туберкулезного комплекса методом пцр в режиме реального времениDETECTION AND DIFFERENTIATION OF NON-TUBERCULOUS MYCOBACTERIA AND M. TUBERCULOSIS COMPLEX BY REAL TIME PCRУстиноваВ. В.UstinovaV. V.

младший научный сотрудник, отдел микробиологии,

 107564, Москва, Яузская аллея, д. 2

Junior Researcher of Microbiological Department,

2, Yauzskaya alleya, Moscow, 107564

ustinoville@gmail.comСмирноваТ. Г.SmirnovaT. G.

старший научный сотрудник, отдел микробиологии,

 107564, Москва, Яузская аллея, д. 2

senior Researcher of Microbiological Department,

2, Yauzskaya alleya, Moscow, 107564

s_tatka@mail.ruВарламовД. А.VarlamovD. A.

Научный сотрудник,

127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 42

Researcher,

42, Timiryazevskaya st., Moscow, 127550

dvarl@mail.ruАндриевскаяИ. Ю.AndrievskayaI. Yu.

младший научный сотрудник, отдел микробиологии,

 107564, Москва, Яузская аллея, д. 2

Junior Researcher of Microbiological Department,

2, Yauzskaya alleya, Moscow, 107564

andrievskaya.iri@mail.ruЛарионоваЕ. Е.LarionovaE. E.

старший научный сотрудник, отдел микробиологии,

 107564, Москва, Яузская аллея, д. 2

senior Researcher of Microbiological Department,

2, Yauzskaya alleya, Moscow, 107564

larionova_lena@mail.ruЧерноусоваЛ. Н.ChernousovaL. N.

ведущий научный сотрудник, заведующая отделом микробиологии,

 107564, Москва, Яузская аллея, д. 2

leading Researcher, Head of Microbiological Department,

2, Yauzskaya alleya, Moscow, 107564

noemail@neicon.ruФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулезаРоссияCentral Tuberculosis Research InstituteRussian FederationФГБНУ «Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии»РоссияAll-Russia Research Institute of Agricultural BiotechnologyRussian Federation2016010920169498087Copyright © Устинова В.В., Смирнова Т.Г., Варламов Д.А., Андриевская И.Ю., Ларионова Е.Е., Черноусова Л.Н., 20162016Устинова В.В., Смирнова Т.Г., Варламов Д.А., Андриевская И.Ю., Ларионова Е.Е., Черноусова Л.Н.Ustinova V.V., Smirnova T.G., Varlamov D.A., Andrievskaya I.Y., Larionova E.E., Chernousova L.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.tibl-journal.com/jour/article/view/934Цель исследования

Цель исследования: определить дизайн праймеров и зондов, специфичных к ДНК нетуберкулезных микобактерий (НТМБ), и оценить их диагностическую значимость при одновременном выявлении НТМБ и M. tuberculosis complex (МБТК) методом ПЦР в режиме реального времени.

Материалы и методы

Материалы и методы. Дизайн праймеров и зондов осуществляли с использованием ПО Primer 3, Primer BLAST, Ugene Uni Pro. Предварительную оценку специфичности и чувствительности выявления ДНК НТМБ проводили на культурах, принадлежащих к 18 видам НТМБ, 16 штаммам МБТК и 14 видам микроорганизмов, не относящихся к роду Mycobacterum. Аналитическую чувствительность оценивали на 284 культурах НТМБ, диагностическую чувствительность - на 124 образцах мокроты. Выделение ДНК проводили набором «М-Сорб-Туб-Автомат» (ЗАО «Синтол»). Культуры подвергали субкультивированию на жидкой среде Middlebrook 7H9 в системе Bactec MGIT 960. Идентификацию культур проводили с использованием стандартных микробиологических методов. Анализ ДНК, выделенной из культур, выполняли c помощью набора реагентов GenoTypeCM/AS (Hain Lifescience, Германия).

Результаты

Результаты. Показаны 100%-ные специфичность и чувствительность ПЦР при работе с культурами микобактерий и 100%-ная специфичность и 69,70%-ная чувствительность при анализе диагностического материала.

Goal of the study

Goal of the study: to define the design of primers and probes specific to DNA of non-tuberculous mycobacteria and evaluate their diagnostic value in case of simultaneous detection of non-tuberculous mycobacteria and M. tuberculosis complex by real time PCR.

Materials and methods

Materials and methods. Primer 3, Primer BLAST, Ugene Uni Pro were used to design primers and probes. Preliminary assessment of specificity and sensitivity of detection of non-tuberculous mycobacteria DNA was performed on cultures belonging to 18 types of non-tuberculous mycobacteria, 16 strains of M. tuberculosis complex and 14 types of microorganisms being none Mycobacterum. Analytic sensitivity was tested on 284 cultures of non-tuberculous mycobacteria and diagnostic sensitivity was tested on 124 sputum samples. The kit ofM-Sorb-Tub-Avtomat (ZAO Sintol) was used for DNA isolation. Cultures were subcultured on the liquid medium of Middlebrook 7H9 in Bactec MGIT 960. Cultures were identified with the use of standard microbiological techniques. Analysis of DNA isolated from cultures was performed by the reagent kit of GenoTypeCM/AS (Hain Lifescience, Germany).

Results

Results. 100% specificity and sensitivity of PCR was demonstrated in mycobacterial cultures and 100% specificity and 69-70% sensitivity was demonstrated in diagnostic material analysis.

нетуберкулезные микобактериимикобактерии туберкулезного комплексаПЦР в режиме реального времениnon-tuberculous mycobacteriaM. tuberculosis complexreal time PCRReferencesОттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз. - СПб.: Медицинская пресса, 2005. - 224 с.Otten T.F., Vasiliev А.V. Mikobaketerioz. [Mycobacteriosis.] St. Petersburg, Meditsinskaya Pressa Publ., 2005, 224 p.Hong Y. J., Chung Y. H., Kim T. S. et al. Usefulness of three-channel multiplex real-time PCR and melting curve analysis for simultaneous detection and identification of the Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria // J. Clin. Microbiol. - 2011. - Vol. 49. - Р. 3963-3966.Hong Y.J., Chung Y.H., Kim T.S. et al. Usefulness of three-channel multiplex real-time PCR and melting curve analysis forsimultaneous detection and identification of the Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 2011, vol. 49, pp. 3963-3966.Lara-Oya A., Mendoza-Lopez P., Rodriguez-Granger J. et al. Evaluation of the Speed-oligo Direct Mycobacterium tuberculosis assay for molecular detection of Mycobacteria in clinical respiratory specimens // J. Clin. Microbiol. - 2013. - Vol. 51. - Р. 77-82.Lara-Oya A., Mendoza-Lopez P., Rodriguez-Granger J. et al. Evaluation of the Speed-oligo Direct Mycobacterium tuberculosis assay for molecular detection of Mycobacteria in clinical respiratory specimens. J. Clin. Microbiol., 2013, vol. 51, pp. 77-82.Luna F.F.-A., Ruiz P., Gutierrez J., Casal M. Evaluation of the GenoType Mycobacteria direct assay for detection of Mycobacterium tuberculosis complex and four atypical mycobacterial species in clinical samples // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44. - P. 3025-3027.Luna F.F.-A., Ruiz P., Gutierrez J., Casal M. Evaluation of the GenoType Mycobacteria direct assay for detection of Mycobacterium tuberculosis complex and four atypical mycobacterial species in clinical samples. J. Clin. Microbiol., 2006, vol. 44, pp. 3025-3027.Michael D. Perry, P. Lewis White, Michael Ruddy. Potential for use of the seegene anyplex MTB/NTM real-time detection assay in a Regional Reference Laboratory // J. Clin. Microbiol. - 2014. - Vol. 52, № 5. - P. 1708-1710.Michael D. Perry, P. Lewis White, Michael Ruddy. Potential for use ofthe seegene anyplex MTB/NTM real-time detection assay in a Regional Reference Laboratory. J. Clin. Microbiol., 2014, vol. 52, no. 5, pp. 1708-1710.Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., the UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. - 2012. - Vol. 28. - Р. 1166-1167.Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., the UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics, 2012, vol. 28, pp. 1166-1167.Richardson E. T., Samson D., Banaei N. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis and Nontuberculous Mycobacteria by Multiplex, Real-Time PCR // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47. - Р.1497-1502.Richardson E.T., Samson D., Banaei N. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis and Nontuberculous Mycobacteria by Multiplex, Real-Time PCR. J. Clin. Microbiol., 2009, vol. 47, pp. 1497-1502.Rozen S., Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers // Methods Mol. Biol. - 2000. - Vol. 132. - Р. 365-386.Rozen S., Skaletsky H. Primer3 on theWWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol. Biol., 2000, vol. 132, pp. 365-386.Shrestha N. K., Tuohy M. J., Hall G. S. et al. Detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis and Nontuberculous mycobacterial isolates by Real-Time PCR // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41. - P. 5121-5126.Shrestha N.K., Tuohy M.J., Hall G.S. et al. Detection and differentiation of Mycobacteriumtuberculosis andNontuberculous mycobacterial isolates byReal-Time PCR. J. Clin. Microbiol., 2003, vol. 41, pp. 5121-5126.Taylor S., Wakem M., Dijkman G. et al. A practical approach to RT-qPCR-Publishingdata that conform to the MIQE guidelines // Methods. - 2010. - Vol. 50. - P. S1-S5. doi: 10.1016/j.ymeth.2010.01.005 PMID: 20215014Taylor S., Wakem M., Dijkman G. et al. Apractical approach to RT-qPCR–Publishingdata that conform to the MIQE guidelines. Methods, 2010, vol. 50, pp. S1-S5. doi: 10.1016/j.ymeth.2010.01.005 PMID: 20215014Thomson R M. Changing epidemiology of pulmonary nontuberculous mycobacteria infections // Emerg. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 16, № 10. - Р. 1576-1583.Thomson R.M. Changing epidemiology of pulmonary nontuberculous mycobacteria infections. Emerg. Infect. Dis., 2010, vol. 16, no. 10, pp. 1576-1583.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.