Выявление и дифференциация нетуберкулезных микобактерий и микобактерий туберкулезного комплекса методом пцр в режиме реального времени

Цель исследования: определить дизайн праймеров и зондов, специфичных к ДНК нетуберкулезных микобактерий (НТМБ), и оценить их диагностическую значимость при одновременном выявлении НТМБ и M. tuberculosis complex (МБТК) методом ПЦР в режиме реального времени.

Материалы и методы. Дизайн праймеров и зондов осуществляли с использованием ПО Primer 3, Primer BLAST, Ugene Uni Pro. Предварительную оценку специфичности и чувствительности выявления ДНК НТМБ проводили на культурах, принадлежащих к 18 видам НТМБ, 16 штаммам МБТК и 14 видам микроорганизмов, не относящихся к роду Mycobacterum. Аналитическую чувствительность оценивали на 284 культурах НТМБ, диагностическую чувствительность - на 124 образцах мокроты. Выделение ДНК проводили набором «М-Сорб-Туб-Автомат» (ЗАО «Синтол»). Культуры подвергали субкультивированию на жидкой среде Middlebrook 7H9 в системе Bactec MGIT 960. Идентификацию культур проводили с использованием стандартных микробиологических методов. Анализ ДНК, выделенной из культур, выполняли c помощью набора реагентов GenoTypeCM/AS (Hain Lifescience, Германия).

Результаты. Показаны 100%-ные специфичность и чувствительность ПЦР при работе с культурами микобактерий и 100%-ная специфичность и 69,70%-ная чувствительность при анализе диагностического материала.

1. Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз. - СПб.: Медицинская пресса, 2005. - 224 с.

2. Hong Y. J., Chung Y. H., Kim T. S. et al. Usefulness of three-channel multiplex real-time PCR and melting curve analysis for simultaneous detection and identification of the Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria // J. Clin. Microbiol. - 2011. - Vol. 49. - Р. 3963-3966.

3. Lara-Oya A., Mendoza-Lopez P., Rodriguez-Granger J. et al. Evaluation of the Speed-oligo Direct Mycobacterium tuberculosis assay for molecular detection of Mycobacteria in clinical respiratory specimens // J. Clin. Microbiol. - 2013. - Vol. 51. - Р. 77-82.

4. Luna F.F.-A., Ruiz P., Gutierrez J., Casal M. Evaluation of the GenoType Mycobacteria direct assay for detection of Mycobacterium tuberculosis complex and four atypical mycobacterial species in clinical samples // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44. - P. 3025-3027.

5. Michael D. Perry, P. Lewis White, Michael Ruddy. Potential for use of the seegene anyplex MTB/NTM real-time detection assay in a Regional Reference Laboratory // J. Clin. Microbiol. - 2014. - Vol. 52, № 5. - P. 1708-1710.

6. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., the UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. - 2012. - Vol. 28. - Р. 1166-1167.

7. Richardson E. T., Samson D., Banaei N. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis and Nontuberculous Mycobacteria by Multiplex, Real-Time PCR // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47. - Р.1497-1502.

8. Rozen S., Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers // Methods Mol. Biol. - 2000. - Vol. 132. - Р. 365-386.

9. Shrestha N. K., Tuohy M. J., Hall G. S. et al. Detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis and Nontuberculous mycobacterial isolates by Real-Time PCR // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41. - P. 5121-5126.

10. Taylor S., Wakem M., Dijkman G. et al. A practical approach to RT-qPCR-Publishingdata that conform to the MIQE guidelines // Methods. - 2010. - Vol. 50. - P. S1-S5. doi: 10.1016/j.ymeth.2010.01.005 PMID: 20215014

11. Thomson R M. Changing epidemiology of pulmonary nontuberculous mycobacteria infections // Emerg. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 16, № 10. - Р. 1576-1583.